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瞬时液滴组织细胞内的生化反应 称为冷凝物的液滴将蛋白质和RNA在需要的时间和地点聚集在一起。现在,他们在制药的雷达
2020年07月15日    阅读量:304     新闻来源:中国化工网 okmart.com    |  投稿

细胞需要在时间和空间上协调各种各样的生化反应。液-液相分离可以通过将分子隔离在高浓度的液滴中来加快或降低反应速度。这些油滴可以合并和分离,类似于醋制醋汁沙拉酱中的油滴中国化工网okmart.com

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Clifford P. Brangwynne将单细胞胚胎捣碎在显微镜载玻片和薄玻璃盖玻片之间。然后他凝视着显微镜,看一眼从实验室中普遍研究的线虫秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)取出的细胞。他期望看到的是由RNA和蛋白质组成的小而实心的小球,散布着细胞。但是,相反,他所看到的看起来更像是世界上最小的熔岩灯。


而不是像漂浮在水罐中的木球那样在整个细胞的液体内部漂移,而是在球团的上方,上方出现,合并和分离,然后消失。Brangwynne当时是马克斯·普朗克分子细胞生物学与遗传学研究所(MPI-CBG)安东尼·海曼实验室的博士后学者,他意识到:这不是固体所能做的。科学家认为是固体的所谓P颗粒实际上表现得像液体。


“突然之间,一切都变得有意义了,”布兰温妮说。科学家一直试图了解细胞如何组织内部发生的生化反应,使其保持分离状态,从而不会产生干扰。他看着显微镜下起伏的小熔岩灯回答了。


Brangwynne通过显微镜观察到的现象称为液相-液相分离(LLPS)。在LLPS中,原本不均匀的混合均匀的液体可以分成两个不同的阶段,就像醋汁沙拉酱会自然地分成瓶子中的油层和醋层一样。


自1940年代以来,高分子化学家就一直在研究这种现象,并着眼于用它来控制高分子的结构。德克萨斯大学西南医学中心的生物物理学家迈克尔·罗森说,尽管生物化学家认识到像RNA这样的生物聚合物与合成聚合物具有许多共同的特性,但没人能提出这种想法来证明LLPS也可能在生物系统中发生。


大约在Brangwynne 于2009年在《科学》杂志上发表他的开创性发现(DOI:10.1126 / science.1172046)的同时,Rosen 发现了LLPS在细胞中发生的另一种方式。他发现,当细胞建立其结构支持物或细胞骨架时,三种有助于建立支架的蛋白质可以从单个亚基转变为液滴状的大型复杂聚合物。


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从那时起,科学家们几乎在所有观察细胞内部的地方都发现了LLPS。细胞通常包含被膜包裹的称为细胞器的确定隔室,而在LLPS过程中瞬时形成的冷凝物会形成无膜细胞器。它们将蛋白质,RNA和其他大分子聚集在一起,在需要的时间和地点进行反应,这是细胞生物化学的组织系统。


更为重要的是,Brangwynne说:“这些液滴通过将反应物浓缩在很小的体积中,从而加快了化学反应的速度。”


自从科学家发现以来,这些冷凝物还可以通过隔离某些分子并将其从循环中移出来减慢附近的反应。从某种意义上讲,LLPS是细胞的化学变阻器,使它们能够响应不断变化的环境条件来微调一系列反应。


最近,生物化学家将注意力集中在好冷凝物变坏时会发生什么。大部分工作都集中在LLPS在神经退行性疾病和癌症中的作用上,两者均与形成然后凝固而不是保持液态的冷凝物有关。生物化学家面临的挑战是发现更多有关冷凝物如何在生理系统而不是细胞模型中发挥作用的方法,并弄清楚如何用药物靶向这种动态和短暂的结构。


简史

1899年,哥伦比亚大学细胞生物学家埃德蒙·比彻·威尔逊(Edmund Beecher Wilson)在海洋生物实验室作了题为“原生质的结构”的演讲。威尔逊根据他对海胆卵的研究,认为细胞内部或细胞质(研究人员将其重命名)是“液体混合物,呈细乳液的形式,由连续的物质组成,其中悬浮有滴剂。” 尽管威尔逊(Wilson)身为最重要的科学家,但没有人跟进这一说法。


在1940年代,合成高分子化学家注意到他们正在研究的许多单体都是多价的,这意味着它们可以与溶液中的其他分子同时形成多个弱的非共价键。它们可以完全溶解在溶剂中,直到达到饱和点为止,在特定的浓度下它们会凝结成溶液中的液滴。单体中的多价度越高,达到饱和点所需的单体浓度越低。


在接下来的60多年中,工业和聚合物化学家都将使用这种现象来分离聚合物的混合物并控制聚合物的形态。对罗森而言,这些合成聚合物的行为与蛋白质和核酸等生物聚合物具有明显的相似之处。


但是生物学家通常不会花很多时间研究工业化学的过程,这些化学家也不了解细胞如何运作的分子细节,或者为什么像LLPS这样的过程会通过将高浓度的成分聚集在一起来帮助促进生化反应。


当Brangwynne在发现P颗粒时,一切都在2008年夏天发生了变化。具有讽刺意味的是,这些发现是在他与实验室主任海曼(Hyman)在同一海洋生物学实验室教授课程的同时激发出来的,威尔逊在109年前发表了演讲。


在课堂上-关于细胞生理学-两名学生注意到最近受精的秀丽隐杆线虫中P颗粒的熔岩灯状行为蛋。当访问讲师回到德国德累斯顿的MPI-CBG时,他们开始更仔细地调查这一现象。Brangwynne越深入研究这个话题,他越意识到相分离可以解释为什么P颗粒可以合并,分离并看起来像遍及整个细胞一样流动。作为物理学家,布兰妮根本不打算这样做。但是这些生物分子缩合物的特性太吸引人了,以至于他无法通过。


他说:“这是一个发现,来自在正确的时间,正确的背景,正确的位置进行。”


他和海曼(Hyman)在德累斯顿(Dresden)辛苦劳作,最终发现P颗粒小滴在单细胞胚胎周围自由运动-直到受精卵第一次分裂为止。Brangwynne发现,在分裂过程中,所谓的极性蛋白质PAR-1和PAR-2将集中在胚胎的一侧,当蛋白质达到足够高的浓度时,P颗粒就会在那里形成。


然后,这些颗粒在细胞的单侧迅速凝结成看起来坚实的蛋白质块。随着胚胎的分裂,颗粒被限制在两个子细胞中的一个。它们在子细胞中的存在会引导胚胎发育成不同的组织,最终变成成虫。


研究人员的突破不仅在于他们确定了可以引导round虫发育的机制,还在于LLPS代表了适用于各种生化细胞过程的有用策略。这些发现“让克利夫通过一种新的视角-实际上是一种新的视角-来看待生命的软物质,”定量细胞生物学家艾米·格拉德费尔特(Amy Gladfelter)说,他在北卡罗来纳大学教堂山分校研究相分离在生物学中的作用。 。


同年,罗森(Rosen)在距离圣安东尼奥市德累斯顿(Dresden)8,851公里的地方,也意识到LLPS是一种有用的策略。但是,罗森(Rosen)正在研究细胞的细胞骨架或结构支架。他的团队发现,三种蛋白质在形成细胞骨架时会形成液滴。


然后,Rosen设计了具有各种重复结合单元的蛋白质,以测量蛋白质结合多个伴侣的能力如何影响其相分离的能力。他发现,具有更多重复序列并因此具有更高化合价的蛋白质在较低浓度下会形成冷凝物-与高分子化学家70年来所看到的相分离趋势有着明显的平行。Rosen的发现指出,蛋白质的多价在LLPS中起主要作用。


他知道结果很重要,但是存在一个主要问题:他认为出版结果理想的顶级期刊拒绝接受他的论文。在《自然》杂志上进行了数年和四轮修订之后,第五位审稿人继续努力。评论家说,罗森的观点太明显了。显而易见,合成聚合物将表现出与蛋白质相似的行为。


罗森说,但这就是重点。他认为,生物学中没有其他人表明这一点,并且该领域需要开始以这种方式思考。经过4年多的争论,罗森(Rosen)在2012年获胜,他的论文发表了(Nature,DOI:10.1038 / nature10879)。


不久之后,生物学家就开始在所见之处到处发现LLPS。核仁是形成核糖体的细胞核内部的致密结构,是一种冷凝物。形成以将DNA转录为RNA的蛋白质簇也是如此。圣裘德儿童研究医院的结构生物学家Tanja Mittag说,它们的功能类似于细胞器,因为液滴将适当的分子聚集在一起以促进化学反应。冷凝物中高浓度的反应物将使反应比分子在稀细胞质中随机相遇的反应更快。


除了没有膜的存在以外,科学家对冷凝物的兴趣在于它们可以响应细胞条件而自发形成。Mittag说,浓度的微小变化会触发液滴的形成,就像轻弹开关一样。


但是,没人能解释的是推动形成的物理和化学过程,以及为什么在某些疾病中冷凝物形成然后固化。


混乱使秩序

随着科学家在细胞中发现更多的LLPS实例,他们开始在经历相分离的许多蛋白质中发现共同点。正如Rosen所发现的,多价是关键,但是研究人员最终确定了一种特别适合多价和LLPS的特定类型的蛋白质基序。


蛋白质的整体三维形状部分源自称为α-螺旋和β-折叠的结构化区域。在这些区域中,角落和缝隙根本没有任何二级结构。根据MPI-CBG的合成生物学家Dora Tang所说,它们“松软”。从技术上讲,这些非结构化区域称为低复杂度域。它们是在LLPS过程中形成的冷凝物中常见的基序。特别是,研究人员发现RNA结合蛋白具有低复杂性结构域,这使其特别容易产生LLPS。


波士顿大学的药理学家本杰明·沃洛津(Benjamin Wolozin)在过去的十年中,一直在更深入地研究低复杂性领域(包括促进LLPS的领域)中的分子相互作用。他发现这些低复杂度结构域中的氨基酸残基参与弱相互作用,例如盐桥,π堆积和阳离子-π相互作用,其中像精氨酸这样的偶极残基与像酪氨酸这样的芳香族残基缔合。


所有这些相互作用在所谓的Goldilocks区中创建了弱键:在那里吸引力足够强,可以将蛋白质的两个部分拉在一起,但足够弱,以至于它们可以相对容易地断裂。这些非共价相互作用是粘滞便笺的分子当量,可以很容易地粘连和不粘连。瞬时键可使大分子聚结成液体。


Wolozin说,细胞中的LLPS看起来很神奇。“它提供了一种惊人的方式,许多不同类型的蛋白质过程可以通过简单的生物物理学来组织自身。”


神经退行性疾病肌萎缩性侧索硬化症(ALS,也称为路格里格氏病)一直是理解LLPS的重点。在ALS中,运动神经元退化并死亡,使人们失去行走,说话和最终呼吸的能力。科学家发现,在ALS患者的运动神经元中,会形成压力颗粒,但不会溶解。这些颗粒是当细胞受到热量,化学物质和其他环境因素的压力时产生的一种冷凝物。但是通常,压力颗粒是短暂的,与压力源一起消失。


2010年,包括沃洛津在内的科学家们发现,RNA结合蛋白TDP-43是应激颗粒的关键成分(PLOS One,DOI:10.1371 / journal.pone.0013250)。这种蛋白质的突变是ALS的特征,使其太粘。代替粘滞便笺,突变的TDP-43蛋白的作用就像胶带一样,液滴凝固成固体聚集体。



十年的工作表明,LLPS的异常在ALS的发展中起着关键作用,科学家认为,针对LLPS的研究不仅可以帮助延缓ALS的发展,而且还可以帮助延缓其他神经退行性疾病甚至癌症的发展,因为科学家已经将所有这些状况联系在一起异常的冷凝水形成。


这就是为什么制药业-包括默克公司(Merck&Co.)在内的巨头以及像露点疗法(Dewpoint Therapeutics)和阿奎那制药公司(Aquinnah Pharmaceuticals)这样的小型新兴企业-在过去几年中对冷凝液产生了浓厚的兴趣。默克公司化学生物学总监Jason Imbriglio说,挑战在于开发一种工具,以实时研究细胞中的冷凝物,以识别可调节其形成和溶解的分子。露点的首席科学官Mark Murcko说,


“我们倾向于认为分子在细胞质中随机游荡。但是冷凝物在特定条件下将特定的分子子集驱动在一起。” Murcko说。


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药物对于任何人来说,了解LLPS都是至关重要的,因为冷凝物本身就是潜在的药物靶标,而且因为相分离可能会在药物在细胞内的功能发挥作用,这也至关重要。


近期的《科学》杂志论文指出,由于相分离的过程,顺铂的抗癌药物不能在细胞内均匀扩散,而是集中在不同的斑点上(2020,DOI:10.1126 / science.aaz4427)。Brangwynne说,这项工作绝非异常,它表明LLPS在细胞化学反应中起着根本性的作用。


Carrie Arnold是位于弗吉尼亚州里士满的自由科学作家。


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