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藻类研究的利器——库尔特计数器
2021年12月01日    阅读量:     新闻来源:中国化工网 okmart.com  |  投稿

通过光学显微镜观察样本,当两个点距离很近时,会因为衍射光斑发生重叠而导致无法分辨,这个极限是光线波长的一半,而可见光波长最小约0.4μm,因此光学显微镜的最大分辨率只有0.2μm左右,这在现代许多科技前沿领域都是乏力的;后来人们又将可见光换成电子束,相当于将波长大大减小,在此基础上开发出分辨率远超光学显微镜的电子显微镜,最佳的透射电子显微镜甚至达到0.2nm(一说可达0.08nm)左右,意即在光学显微镜的基础上放大了1000倍以上,籍此电镜成为当前观察微观世界的极限手段,但电镜除了操作复杂,价格昂贵,在制备观察样本时还有相当的局限性(不能观察活性样本,难以进行数据统计分析)。


藻类研究的利器——库尔特计数器 中国化工网,okmart.com

左:光学显微镜分辨率低右:电子显微镜笨重昂贵且有局限


在生物领域,细菌和藻类测试是很典型的例子。比如大多数已知细菌的直径在0.4至2μm之间,长度在0.5至5μm之间,不仅研究对象接近光学显微镜的分辨率极值,而且当样本中不同菌种体积差异过大时,光学对焦也无法做到兼顾;还有藻类检测指标非常繁多,往往包括多样性检测、水质指标、密度、生物量等众多内容,但通用国标或是地方标准的适用范围更多针对常规性质的检测或研究(例如2021年4月刚刚实施的江苏省地方标准,淡水浮游藻类检测技术规范明确光学显微镜用于粒径>3μm藻类的监测),无法满足细胞尺寸更小的藻类的研究中国化工网okmart.com。这时,研究人员就会面临难题——光学显微镜难以胜任分辨率要求更高的超常规研究,同时,电镜又不能观察活性样本,且难以进行数据统计分析。是否存在一种可以弥补二者不足的有效途径和方法,得出的分析结果既简便准确又有统计意义呢?


案例分享


20世纪初,科学家们发现红球藻是一种富含天然抗氧化物质虾青素的藻类,而虾青素是自然界迄今为止发现的最强的抗氧化剂,从此,一场红球藻研发的科研攻关战在世界打响了,全世界生命科学的顶尖科学家从此开始了100年的探索。直到今天,红球藻依然被公认为自然界中生产天然虾青素的最好生物,因此,利用这种微藻提取虾青素已成为近年来国际上天然虾青素生产的研究热点。


但是,长期以来研究进展缓慢,目前有能力商业化养殖红球藻生产天然虾青素的国家和公司屈指可数,这其中的佼佼者以色列Algatech公司(2019年被法国化妆品生产和制药行业的天然成分生产商Solabia集团收购)正是借助库尔特(电阻法)颗粒计数器——Multisizer,从而交出了一份令人满意的答卷。


红球藻的产业化养殖

Algatech微生物研究中心曾进行多次海洋科考,研究藻类、蓝细菌和其它光养细菌的光合作用调节和细胞分裂机制时需要对细胞数目和体积进行定量分析。在实验室或室外培养过程中,海洋微生物研究人员需要对悬浮液中的细胞进行计数,监测各种菌株和突变体中细胞大小的变化,根据生长条件监测细胞大小和数量的依赖性,并在同步培养的细胞分裂周期内跟踪这些变化。常用的细胞计数和大小分析的检测方法是使用光学显微镜和计数板,但是蓝藻和原绿球藻是营养贫乏海洋中重要的一级生产者,其细胞直径仅为0.6至0.9μm,光学显微镜无法检测到,于是就来到Multisizer的表演时间——


研究团队对光合作用的变化和基因表达的调节感兴趣。对于这些测量,不仅需要知道所采集样品中的细胞数量,而且还需要知道与所测量的活性或其它分析参数(色素,蛋白质等的数量)相关的细胞的体积。结果表明,细胞体积在光照下(白天)增长,但不同菌株的生长动力学有所不同。


图1:实验室同步培养生长的杜氏藻(绿色)和球等鞭金藻(红色)体积变化。细胞的体积随光照逐渐增加,在光照结束时达到最大值。生长条件:光照阶段为0到12小时,光照强度逐渐增加,在第六个小时左右到达最大值,然后逐渐降低。在第12小时和第24小时之间,细胞处于黑暗中(标为黑色)。

再就是在藻类同步培养中监测生长过程,绿藻很容易通过明暗交替的光照进行同步培养,使用这种方法,很容易获得处于相同细胞周期且同步通过细胞周期的细胞群体。应用Multisizer测量的细胞体积不仅可以用作培养物生长过程的信息,而且还可以详细说明细胞分裂的过程,这和同步培养绿藻莱茵衣藻是一样的(图2)。Multisizer的结果证实,新的细胞亚群是由原始同质的亲本细胞群形成的子细胞(图2B)并可定量,通过光学显微镜的照片可验证这两类细胞群(图2A)。


Algatech自从2000年配备Multisizer便进行了大量的数据研究,操作简单易用、稳定性高、数据可靠等让Multisizer成为许多用户、学生竞相使用的设备。尽管在远航科考中已使用十多年,但该设备依然能够可靠运行,Multisizer进行细胞计数和大小测量的可行性和耐用性得到证实后,在欧盟资助的“藻类生物技术中心-Algatech”项目上,为致力于藻类研究领域中基础设施的建设和仪器功能的开发,该中心又配备了更多的Multisizer。


关于Multisizer4e库尔特(电阻法)颗粒计数器


电阻法原理示意图

待测细胞/颗粒悬浮于装有电解液的样品杯中,测试时,真空泵会吸取含有细胞/颗粒的电解液通过小孔管,在小孔管内外电极间施加恒定电流的情况下,当有一个细胞/颗粒通过小孔管时,其会置换掉同等体积的电解液,导致电极间的电压发生变化,即形成一个电压脉冲,细胞/颗粒的数目和大小与电压脉冲的数目和高低成正比。通过测试产生的脉冲信息,便可在数字化处理后获得我们看到的粒度分布和样品浓度。


缺点


与显微镜类设备不同,Multisizer是基于库尔特(电阻法)原理,根据电脉冲高度和电脉冲数目实现简单快速分析细胞/颗粒大小和浓度的仪器,因此不能提供拍照功能和图片信息;并且对于宽粒度分布样品,需要事先过滤分级,避免大颗粒样品堵塞管路的风险。


优点


库尔特原理与其他粒度表征方法如图像法、光学类方法相比,具有准确的细胞/颗粒计数、直径、体积等测试功能,这些参数则是关系到细胞健康、产品质量和颗粒浓度表征等至关重要的数据。



总结


库尔特(电阻法)颗粒计数器可以在几秒钟内客观地分析成千上万个细胞/颗粒的大小和浓度,因此可以适应大量样品的测试需求;而且不同于手动方法中取样量少、人为误差大的情况,因此能为用户提供了更加客观且更具统计意义的抽样测试。毫不夸张地说,作为一种精确的统计测量工具,它无疑能够弥补显微镜工具的先天不足,提供更准确、更真实、更细节、更全面的信息,从而满足甚至超越研究人员/企业的期望。


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