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北京化工大学徐福建、俞丙然​《AFM》:​用于有效治疗多重耐药生物膜感染性角膜炎的细菌靶向光动力纳米组件,中国化工网,okmart.com
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北京化工大学徐福建、俞丙然​《AFM》:​用于有效治疗多重耐药生物膜感染性角膜炎的细菌靶向光动力纳米组件
2021年12月21日    阅读量:     新闻来源:中国化工网 okmart.com  |  投稿

细菌性角膜炎可导致角膜穿孔,甚至失明,通常是多药耐药细菌感染的结果。绿脓杆菌对抗生素具有天然耐药性,很难用临床可用的抗生素清除,生成的生物膜是细菌性角膜炎的主要病因。抗菌光动力疗法(aPDT)是一种很有前途的抗耐药细菌的杀菌方法,然而,使用广谱aPDT杀灭细菌可能会导致正常细胞的微生物群失衡,造成严重的副作用中国化工网okmart.com。绿脓杆菌含有两种凝集素,Lec A(d-半乳糖特异性)和LecB(l-海藻糖特异性),它们在绿脓杆菌的宿主识别、组织粘附和生物被膜形成中发挥重要作用。针对Lec A是一种很有前景的方法来对抗绿脓杆菌感染,而不会引起耐药性、细菌突变或损害正常宿主哺乳动物细胞。


北京化工大学徐福建教授、俞丙然副教授以及北京协和医院睢瑞芳教授团队共同设计并合成了具有可控结构和分子量的二嵌段共聚物PαGal50-b-PGRB20,该聚合物能有效分散生物膜,并通过与胞外聚合物中的Lec A结合,选择性杀灭生物膜内的绿脓杆菌,并作用于广谱aPDT引起的低光毒性绿脓杆菌膜上。PαGal50-b-PGRB20通过破坏DNA、RNA、蛋白质和细胞膜具有杀菌活性。绿脓杆菌感染角膜炎模型的体内研究表明,PαGal50-b-PGRB20具有改善、恢复角膜的潜力。这项研究提供了一种专用的抗菌材料,可以优先杀死耐多种药物的绿脓杆菌而不是正常细胞和其他细菌,以题为“Bacteria-Targeting Photodynamic Nanoassemblies for EfficientTreatment of Multidrug-Resistant Biofilm Infected Keratitis”发表在最新一期的《Advanced Functional Materials》上。

北京化工大学徐福建、俞丙然​《AFM》:​用于有效治疗多重耐药生物膜感染性角膜炎的细菌靶向光动力纳米组件 中国化工网,okmart.com

图1:细菌靶向纳米组装体合成及其应用示意图。 


【PαGal50-b-PGRBn的合成与表征】


通过可逆加成断裂链转移(RAFT)聚合和开环反应得到了二嵌段共聚物PαGal50-b-PGRBn。核磁共振氢谱显示了αAcGEMA的典型化学位移。PαGal50-b-PGRBn在疏水相互作用驱动下自发组装成胶束,胶束呈球形,干燥状态下样品的实际尺寸略小于流体动力直径。PαGal50-b-PGRB20具有荧光性质,最大发射波长为610 nm。荧光法观察PαGal50-b-PGRB20在细胞内的分布。细菌内部可见黄色荧光(红绿两色合并),表明PαGal50-b-PGRB20可以进入细菌细胞质。流式细胞术发现PαGal50-b-PGRB20与胰蛋白酶处理后绿脓杆菌的结合率显著低于PαGal50-b-PGRB20直接处理的菌群。由此可见,PαGal50-b-PGRBn与绿脓杆菌的结合是由于α-d-半乳糖与Lec A的特异性结合所致。


【活性氧的检测与抗菌机理】


高浓度的活性氧可以杀死细菌,引入四碘四氯荧光素(RB)作为光敏剂,PαGal50-b-PGRBn在光照下产生活性氧(ROS),激发抗菌活性。在没有照射的情况下,经PαGal50-b-PGRB20处理的菌落在琼脂平板上生长良好,表明ROS是抗菌PDT的关键因素。电子自旋共振(ESR)技术检测了1O2和•OH的生成。PαGal50-b-PGRB20改变了绿脓杆菌胞内膜在光照下的渗透性,这可能是由于1O2与胞内不饱和脂质的反应导致胞内膜渗透性的改变。收集PαGal50-b-PGRB20光照处理后绿脓杆菌的基因组DNA和蛋白质,与对照组相比,提取的DNA和蛋白质的条带变弱,表明绿脓杆菌内的ROS对DNA和蛋白质造成了损伤。对毒力基因进行RT-qPCR分析,PαGal50-b-PGRB20组各毒力因子基因表达量均低于对照组,说明PαGal50-b-PGRB20在光照下可以下调绿脓杆菌毒力因子。


【PαGal50-b-PGRBn的选择抗菌性】


探索了PαGal50-b-PGRB20对LB培养基的最低抑菌浓度(MIC)和最低杀菌浓度(MBC)。常规抗菌药物对绿脓杆菌的MIC均高于其断点,表明常规抗菌药物在临床上已失效。PαGal50-b-PGRB20的MIC和MBC分别为64µg mL−1和128µgmL−1,表明PαGal50-b-PGRB20对绿脓杆菌具有杀菌活性而不是抑制活性。探究了PαGal50-b-PGRB20是否能够杀死研究中常用的革兰氏阴性菌KR-K12和一种重要的病原体鲍曼不耐菌。结果表示,辐照对PαGal50-b-PGRB20的KR-K12和鲍曼不耐菌的杀伤作用可以忽略不计,进一步证明PαGal50-b-PGRB20与绿脓杆菌的络合是由于α-d-半乳糖与Lec A的特异性结合。


【体内绿脓杆菌生物膜感染角膜炎的有效治疗】


基于体外抗菌和生物相容性结果,建立绿脓杆菌感染角膜实验模型,探讨PαGal50-b-PGRB20的治疗效果。角膜荧光素染色检测PαGal50-b-PGRB20在光照下是否会损伤角膜上皮。两组实验兔的荧光强度与对照组兔相似,说明PαGal50-b-PGRB20在光照下不会损伤角膜上皮。兔绿脓杆菌感染角膜炎后,治疗组和未治疗组均观察到角膜浸润伴化脓性分泌物、角膜水肿、混和充血及新生血管形成,而未治疗组的症状更为严重。未治疗组于第7天观察到角膜溃疡。第14天,未治疗组出现角膜葡萄膜瘤,且角膜白斑和新生血管的严重程度高于PαGal50-b-PGRB20组。PαGal50-b-PGRB20组几乎没有菌落,而未处理组仍有菌落出现。与治疗组相比,未处理组IL-8和VEGF浓度明显升高。这表明未经治疗的组有更严重的炎症反应。


【小结】


综上所述,该研究成功合成了一系列结构可控、分子量合适的靶向双嵌段共聚物PαGal50-b-PGRBn,能特异性结合生物膜基质和绿脓杆菌中的Lec A,在不引起细菌突变或破坏正常宿主哺乳动物细胞的情况下,解决了绿脓杆菌形成的生物膜,并在光照射下产生ROS杀死绿脓杆菌。体内研究进一步证明PαGal50-b-PGRB20可显著消除绿脓杆菌生物膜,进而促进绿脓杆菌生物膜感染角膜炎的恢复。该研究为设计和合成安全有效的抗菌材料对抗绿脓杆菌生物被膜感染提供了一种潜在的方法。


标签:化工应用技术中心今日头条生物化学生物制药
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